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PROPOSITION SUJET DE THESE

TWEAK et anticorps anti-TWEAK: quels effets modulateurs de la neuroinflammation dans la sclérose en plaques?

 

Équipe : Neuroinflammation et sclérose en plaques

Directeur de Thèse : Sophie DESPLAT-JEGO (MCU-PH1)

Positionnement du projet

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune et inflammatoire chronique démyélinisante associée à un afflux de leucocytes dans le système nerveux central (SNC). Dans sa forme rémittente, elle évolue par poussées inflammatoires entrecoupées de rémissions. Les poussées sont évaluées en routine par imagerie par résonnance magnétique du SNC mais différents facteurs en limitent la prescription. Un biomarqueur de neuroinflammation serait utile à la prise en charge des patients atteints de SEP. TWEAK est une cytokine de la famille du TNF produite sous forme membranaire et soluble par la famille des monocytes/macrophages. Au cours de la SEP, une surexpression de TWEAK est observée au niveau des foyers inflammatoires. Notre équipe a montré que i)l’inhibition de TWEAK réduit la sévérité de la maladie et le nombre de cellules inflammatoires dans le SNC dans un modèle murin de SEP (EAE), ii) In vitro l'exposition de la barrière hémato-encéphalique(BHE) à TWEAK augmente sa perméabilité et révèle une stimulation des gènes impliqués dans la voie de transmigration des leucocytes, iii)les taux sériques de TWEAK soluble sont significativement élevés chez les patients SEP en phase inflammatoire et iv) des auto-anticorps circulants anti-TWEAK sont produits par 48%des patients. TWEAK est un biomarqueur potentiel de l’activité inflammatoire de la SEP. Toutefois son origine tissulaire et son devenir au cours des processus neuroinflammatoires de la SEP/EAE sont encore mal caractérisés.

Objectifs

Déterminer si au cours de la SEP/EAE i) le TWEAK soluble sanguin parvient au SNC, ii) des complexes immuns TWEAK-anticorps anti-TWEAK se forment dans le tissu nerveux, iii) la production d’anticorps anti-TWEAK est associée à une modulation de la neuroinflammation.

Méthodes

Nous étudierons i) le transport du TWEAK soluble à travers l’endothélium cérébral in vitro et in vivo chez la souris après injection de TWEAK marqué ii) la présence de complexes immuns TWEAK dans le tissu nerveux de souris contrôles et EAE, iii) l’association entre neuroinflammation et production d’anticorps anti-TWEAK chez les patients SEP (collaboration J. Pelletier CHU Marseille et P. Labauge CHU Montpellier).

Résultats attendus

Au cours de la SEP/EAE, i) il existe un passage de TWEAK du sang vers le cerveau à travers la BHE, ii) des complexes immuns TWEAK-anti-TWEAK se forment et modulent les effets de TWEAK, iii) les patients qui produisent des anticorps anti-TWEAK présentent des formes moins inflammatoires de leur maladie.

Profil du candidat demandé

Intéressé par la neuroimmunologie, dynamique, motivé, et travailleur, le candidat devra faire preuve de créativité, de curiosité, d’esprit critique mais aussi d’esprit d’équipe.

PROPOSITION SUJET DE THESE

Rôle du long ARN non-codant Neat1 dans la physiologie circadienne de l’horloge hypophysaire

 

Équipe: Genes rythmes et Neurophysiopathologie

Directeur de Thèse : Dr François-Bellan Anne Marie (CRHC INSERM)

Positionnement du projet

La plupart des fonctions physiologiques ou comportementales des organismes oscillent sur une période de 24 heures. C’est l’horloge circadienne qui, à traversl’expression rythmique de gènesau niveau cellulaire, gouverne la rythmicité de cesfonctions. On découvre aujourd’hui que ces rythmes d’ARNm reposent davantage sur des mécanismes post-transcriptionnels rythmiques que sur une transcription rythmique. Nous avons identifié, dans une lignée de cellules hypophysaires, un mécanisme post-transcriptionnel qui implique des structures nucléaires, les paraspeckles dont le nombre varie au cours de 24h dans le noyau des cellules. Les paraspeckles sont des sous-domaines nucléaires composés d’un long ARN non codant, Neat1, et de protéines associées et ils sont capables de retenir dans le noyau des ARNs. Nous avons montré que la rythmicité des paraspeckles qui découle de la rythmicité d’expression de leurs constituants (Neat1 et protéines associées) entraine une rétention nucléaire rythmique des ARNm cibles avec en corollaire un rythme d’expression de ces ARNm.

Objectifs

  1. élucider les mécanismes qui concourent à une rythmicité d’expression de Neat1. Nos données actuelles suggèrent une transcription rythmique de Neat1 dont nous poursuivrons la caractérisation.
  2. évaluer quantitativement la contribution de Neat1 au transcriptome circadien des cellules hypophysaires. Une analyse différentielle du transcriptome rythmique de cellules wild-type comparées à des cellules KO Neat1 récemment établies sera réalisée.
  3. caractériser les déterminants moléculaires des ARNms qui les rendent cibles des paraspeckles.
  4. caractériser le rôle plus spécifique de Neat1dans les fonctions endocriniennes hypophysaires, en particulier son rôle régulateur surl’expression du gène hormonal de la prolactine que nous avons mis en évidence.

Méthodes

  • clonage de régionspromotrices, de régions 3’-UTR
  • réalisation de constructions moléculaires
  • mutagénèse dirigée
  • transfection cellulaire
  • édition génétique par la technique CRISPR/Cas9
  • utilisation de siRNA
  • RNA pull-down
  • Immunoprécipitation de la Chromatine
  • RT-qPCR
  • analyse bioinformatique de données NGS
  • analyse de la rythmicité circadienne à l’aide d’un appareil «Lumicycle»

Résultats attendus

Ce projet permettra de préciser le rôle de Neat1 dans la physiologie hypophysaire ainsi que les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ses effets. De plus en plus de données rapportent le rôle de longs ARN non-codants dans la pathogénie de nombreuses maladies. Décoder les mécanismes moléculaires qui impliquent l’un d’entre eux dans le fonctionnement de l’horloge hypophysaire peut, dès lors à terme, permettre d’identifier des candidats moléculaires participant à l’étiologie de pathologies impliquant les hormones hypophysaires chez l’homme.

Profil du candidat demandé

Le candidat aura de solides bases en neuroendocrinologie et en biologie moléculaire et un intérêt tout particulier pour la chronobiologie.

THESIS SUBJECT PROPOSAL

Vectorization of therapeutic antibodies for increased brain delivery and efficacy in Alzheimer’s disease

 

Team : BBB and Neuroinflammation

Thesis supervisor : Michel Khrestchatisky (DR1 CNRS)

State of the art

Alzheimer’s disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder whose aetiology remains unknown. However, numerous studies highlighted the aggregation of Aβpeptides and hyperphosphorylated Tau protein that promote senile plaques and neurodegeneration. Recent Aβ immunotherapy showed efficacy for the first time in clinical trials, but one of the major drawbacks for the therapeutic antibodies (mAbs) is their limited access into the brain: very high doses of antibodies need to be administered to override the BBB with severe side effects. There is a strong need to improve mAb distribution into the CNS, in order to increase their efficacy and reduce side effects. The BBB & Neuroinflammation team and its partner (INP-Vect-Horus LabCom) have a solid experience in the development of vectors to transport biologics across the BBB (6 patent families, 75 patents worldwide).

Objective

Our main goal is to validate our most promising vectors by conjugating them to an anti-Aβ mAb, to determine vectorized mAb brain distribution and to assess therapeutic efficacy in a mouse model of AD.

Methods

Aim 1 -Genetic engineering and production of vector-mAb conjugates. Conjugates will be developed by combining several of our vectors with a prototypic anti-AβmAb developed for the clinic (mAb158, Bioarctic Neuroscience, humanized version BAN2401).

Aim 2 -Evaluation of BBB crossing in vitro and in vivo of vector-mAb conjugates. The conjugates will be tested on in vitro BBB models, the 5 most promising conjugates will be administered i.v. and their distributions will be analyzed. Pharmacokinetic studies will be performed using ELISA tests.

Aim 3 -Evaluation of vector-mAb conjugate efficacy in a mouse model of AD. The most promising conjugates (2 maximum) will be scaled-up to conduct a target engagement and efficacy study in the 5XFAD mouse model of AD. Free antibody and its vectorized versions will be administered i.v. weekly for 1 to 4 months to 5XFAD mice followed by histopathological analysis and behavioral tests.

Expected results

The proposed project will allow evaluation of the potential of different vectors to transport a therapeutic mAb into the brain and elicit efficacy. Following the proof of concept, the best vectors will be used further for brain delivery of different therapeutic antibodies, proteins or enzymes in different CNS diseases.

Candidate profile

The candidate is expected to develop skills in genetic engineering, in vitro and in vivo studies, and to evaluate the neurotherapeutic potential of drug candidates in an animal model of a major CNS disease.

THESIS SUBJECT PROPOSAL

Functional organization of axonal actin

 

Team:  NeuroCyto: the neuronal cytoskeleton in health and disease

Thesis supervisor: Marie-Jeanne Papandréou (MCU AMU)

Co-director : Christophe Leterrier

State of the art

The overall goal of this project is to understand how actin shapes the organization and physiology of axons. In neurons, axons generate and propagate action potentials, transmitting signals to target cells. Their extraordinary architecture must be robust and adaptable, and this is ensured by a unique organization of the axonal cytoskeleton: microtubules, actin and neurofilaments (1). Axonal actin organization has recently been completely redefined by studies using optical super-resolution microscopy, notably Single Molecule Localization Microscopy (SMLM, a modality with ~20 nm resolution comprising techniques such as STORM, PALM, and DNA-PAINT). Actin forms regularly-spaced submembrane rings connected by spectrin tetramers, but the composition and assembly mechanisms of this periodic complex are still unknown. Moreover, we discovered that actin also forms dynamic intra-axonal clusters every 3-4 μm that we termed “hotspots” from which “trails” of filaments assemble and disassemble along the axon within seconds (2). Almost everything remains to be discovered about these axonal actin assemblies, most importantly their cellular functions (3).

Objective

The objective is to define the molecular organization of axonal actin structures and determine their functions for axonal growth, maintenance and transport.

Methods

The student will combine live-cell imaging, state-of-the-art multicolor SMLM and quantitative analysis approaches. This will allow to study identified actin structures from dynamics to nanoscale detail. Moreover, we will devise specific perturbation strategies that will be coupled to correlative imaging. We will determine molecular partners specific to each of the actin structures, selectively perturb them and determine the impact on axonal growth, maintenance and physiology.

Expected Results

This work will provide innovative correlative approaches (4) between live-cell imaging and super-resolution microscopy to decipher the neuronal architecture. The student will characterize the dynamics and interplay of identified axonal actin structures, as well as devise innovative analysis strategies (5) to obtain a quantitative, comprehensive model of axonal actin organization. The ultimate biological goal of this project is functional insight: identification of partners specific to each of the actin structure sand their selective perturbation will reveal the yet unknown functions of actin structures in the cellular physiology of the axon.

Candidate profile 

We are looking for a dedicated team player with a background in neuronal cell biology, advanced microscopy and/or image analysis.

PROPOSITION SUJET DE THESE

L’Apolipoprotéine E humaine comme un modulateur de processus neuro-pathogéniques dans la maladie d’Alzheimer

 

Equipes  : Plasticité et Dégénérescence Neurales et Cellules souches, modélisation des maladies et neurorégénération

Directeur de Thèse : Santiago Rivera (DR2 CNRS)

Codirecteur : Emmanuel Nivet (CR CNRS)

Positionnement du projet

L’Apolipoprotéine E (APOE) humaine présente un polymorphisme et les porteurs du variantAPOE-ε4 ont un risque augmenté pour la maladie d’Alzheimer (MA). Ceci place l’APOE comme un déterminant cellulaire critique pour étudier la maladie et chercher à identifier, ou mieux comprendre, certains des mécanismes pathogéniques associés. L’APOE cérébrale est majoritairement d’origine gliale, permettant d’envisager d’étudier son impact pathogénique sur les cellules gliales et sur les interactions neuro-gliales. Nos résultats ont mis en évidence un rôle important de l’APOE dans la réponse inflammatoire astrocytaire et suggèrent que la glie joue aussi un rôle dans le contrôle de mécanismes pathologiques au sein des neurones via l’APOE.

Objectifs

L’objectif est d’investiguer l’APOE humaine comme un régulateur fonctionnel capable de moduler des mécanismes pouvant être altérés précocement dans la MA. Trois sous-objectifs sont définis :

1) Etudier l’impact d’APOE et son polymorphisme sur la réactivité gliale et autres fonctions gliales importantes dans la MA ;

2) Déterminer l’impact d’APOE et son polymorphisme dans la communication neuro-gliale à travers ses conséquences sur l’amyloïdogenèse et les mécanismes associés;

3) Evaluer l’impact fonctionnel d’une modulation d’APOE.

Méthodes

Des cellules astrocytaires, microgliales et neuronales seront différenciées à partir de cellules iPS humaines modifiées par CRISPR-Cas9 pour présenter différents statuts génotypiques d’APOE. L’objectif #1 impliquera des analyses génomiques, secretomiques et des tests in cellulo pour déterminer des corrélations entre l’état de réactivité des cellules gliales, leur statut génotypique et certaines altérations fonctionnelles comme une diminution de la capacité de clairance d’Aβ. L’objectif #2 nécessitera la mise en place de co-cultures neurones-glie pour évaluer l’impact d’APOE et son polymorphisme sur l’amyloïdogenèse en mesurant notamment les niveaux de production des peptides Aβ, ainsi que des analyses en imagerie pour étudier l’impact sur le réseau endosome-lysosome neuronal. Dans un troisième objectif, nous utiliserons des approches de surexpression et perte de fonction ciblant des protéase actives dans la protéolyse d’APOE et/ou ses récepteurs afin d’évaluer l’impact fonctionnel. Des approches pharmacologiques seront également envisagées.

Résultats attendus

Nous attendons démontrer que l’APOE4 altère : i) les mécanismes neuroinflammatoires supportés par les cellules gliales ; ii) les processus cellulaires neuronaux et gliaux assurant un équilibre production/dégradation d’Aβ. Nous anticipons que la modulation d’APOE peut contrôler ces processus pathogéniques.

Profil du candidat demandé

Expérience souhaitée en culture cellulaire (iPS) et différenciation cellulaire, ainsi qu’une maitrise de méthodes de biochimie (ex. Western Blot, ELISA). Une expérience en édition du génome et/ou imagerie et/ou pharmacologie serait un atout.