Conception de l'expérience

Lors de la conception de l'expérience, il est essentiel de :

1- vérifier la compatibilité de l'échantillon avec l'instrument

Assurez-vous que l'échantillon peut être imagé sur l'instrument choisi, en tenant compte de sa taille et des conditions environnementales (température et gaz) nécessaires pour maintenir des conditions physiologiques. La distance de travail des objectifs est souvent un facteur limitant pour les échantillons épais, les boîtes de Petri et les plaques multipuits avec un fond épais (>170 micromètres). Cette distance doit être vérifiée sur la fiche technique du microscope ou auprès du personnel de la plateforme.

2- d'adapter le porte-échantillon à la platine du microscope

Assurez-vous que le porte-échantillon (lame, boîte de Petri, plaque multipuits) puisse être installé sur la platine du microscope et que toutes les zones d'intérêt soient accessibles. Par exemple, les puits périphériques des plaques multipuits sont souvent inaccessibles à fort grossissement.

3- de s’assurer de la compatibilité des fluorophores avec le microscope

Vérifiez que les fluorophores peuvent être excités et détectés avec le microscope choisi, en vous référant aux caractéristiques des sources d'illumination et des filtres pour la détection de la fluorescence.

4- Limiter la diaphonie entre les fluorophores

Évitez ou limitez la diaphonie entre les excitations et émissions des fluorophores (crosstalk/bleed-through) en choisissant la combinaison optimale de fluorophores à l'aide d'une visionneuse de spectres (Fluorescence SpectraViewer ou FP Base SpectraViewer).

Le montage des échantillons

Cette étape est cruciale car elle consiste à finaliser les derniers éléments du chemin optique du microscope en ajoutant le milieu de montage et la lamelle de verre, afin de pouvoir observer vos échantillons. Toute déviation par rapport aux paramètres optiques pour lesquels le microscope et l'objectif ont été conçus entraînera une dégradation de la qualité des images, même si le marquage est excellent.

1- le milieu de montage

Il existe plusieurs raisons de placer votre échantillon fixé dans un milieu de montage lors de l'imagerie :

• Pour aider à maintenir l'échantillon en place pendant l'imagerie
• Pour empêcher l'échantillon de se dessécher
• Pour mieux correspondre à l'indice de réfraction de l'objectif utilisé
• Pour prévenir le photoblanchiment
• Pour préserver l'échantillon dans le temps en vue d'un stockage à long terme

Attention ! N'utilisez pas de milieu de montage contenant du DAPI (Hoechst, iodure de propidium ou autres marqueurs de la chromatine). Le DAPI est un fluorophore aux spectres d'excitation et d'émission larges. S'il est présent dans votre milieu de montage, il ajoute une fluorescence de fond à votre échantillon ! Bien qu'il soit plus brillant lorsqu'il est lié à l'ADN, il reste fluorescent même lorsqu'il ne l'est pas, flottant dans le milieu de montage, augmentant ainsi le bruit de fond et réduisant le contraste de votre image. De plus, si votre milieu de montage polymérise, le DAPI diffusera de manière hétérogène dans l'échantillon, créant un gradient visible. Pour marquer votre échantillon avec du DAPI, diluez-le dans un tampon, incubez, puis rincez.

La plateforme recommande l'utilisation du Prolong Glass, particulièrement adapté à la microscopie à haute résolution. Son indice de réfraction de 1,52 après le durcissement est très proche de celui du verre optique et de l'huile à immersion (1,518). Ce milieu de montage contient également des agents anti-photoblanchiment et durcit après quelques heures, facilitant ainsi la manipulation et assurant une meilleure conservation de l'échantillon sur le long terme.

2- La lamelle de verre

Les objectifs modernes sont conçus pour imager un échantillon à travers une lamelle de verre d'une épaisseur de 170 micromètres. Toute déviation par rapport à cette valeur dégradera fortement la qualité de l'image, en particulier lors de l'utilisation d'objectifs à grossissement supérieur à ~32x ou à ouverture numérique supérieure à ~0,4. La plateforme recommande fortement l'utilisation de lamelles de calibre 1.5H pour la microscopie.

3- Le cas des échantillons vivants

Le milieu de montage doit maintenir les conditions physiologiques (pH, nutriments, etc.) essentielles à la survie de l'échantillon, tout en le protégeant du photoblanchiment et de la phototoxicité.

Plusieurs options de milieux s'offrent à vous pour les expériences d'imagerie :

1. Milieu de culture cellulaire :
   • Composition : mélanges de minéraux, vitamines, acides aminés, acides nucléiques, sucres, lipides et autres composés biochimiques, généralement additionnés de sérum.
   • Tamponnage du pH : repose sur le bicarbonate et le CO₂ externe, essentiels à la régulation du pH interne des cellules.
   • Limites : l'illumination peut induire la fluorescence de certains composants (vitamines B, protéines, rouge de phénol), augmentant le bruit de fond, ou générer des espèces réactives de l'oxygène, nuisibles aux cellules.
   • Solution : Il existe des milieux (commerciaux ou sur mesure) conçus pour soutenir la croissance cellulaire, mais formulés sans les composants (sans rouge phénol à minima) des milieux de culture traditionnels qui contribuent à la fluorescence de fond.

2. Solutions salines :

   • Avantages : meilleure clarté optique.
   • Tamponnage du pH : peut reposer sur le bicarbonate et le CO₂ externe, ou sur un tampon synthétique comme l'HEPES.
   • Limites : ne soutiennent pas la croissance cellulaire à long terme, ce qui peut être problématique pour les expériences prolongées ou nécessitant une activité métabolique élevée.