Les gliomes sont les tumeurs les plus fréquentes du système nerveux central. Le mécanisme majeur qui contrôle la croissance des gliomes n’est pas le fait d’un seul facteur ou d’un seul type cellulaire : il est plutôt le résultat d’interactions réciproques entre les cellules tumorales elles-mêmes et les cellules du micro-environnement tumoral. Plusieurs types cellulaires sont présents dans les gliomes : les cellules souches cancéreuses (CSC : CD133…), les cellules gliales tumorales, les cellules gliales réactionnelles (astrocytes), les cellules endothéliales, les cellules murales (cellules musculaires lisses (VSMC, péricytes)) et les cellules inflammatoires. On peut raisonnablement penser qu’il existe des interactions réciproques entre ces types cellulaires. Dans ce contexte, notre hypothèse est que l’Adrénomedulline (AM) serait un des maillons impliqués dans ces communications intercellulaires. L'AM est un peptide de 52 acides aminés amidé en C-terminal largement exprimé dans une variété de types de tumeurs et s'est révélé mitogène pour de nombreuses lignées de cellules cancéreuses humaines in vitro. L'AM se lie et transmet son activité par l'intermédiaire du récepteur de la calcitonine (CLR) couplé à la protéine G, la spécificité pour AM étant conférée par la protéine -2 modifiant l'activité du récepteur (RAMP2) et -3 (RAMP3). L'ablation génétique de AdM, calcrl, Ramp2 ou de l'enzyme responsable de l'amidation la peptidylglycine α-amidating monooxygenase (PAM) aboutit à une létalité associée à un œdème interstitiel et à des défauts cardiovasculaires graves. Des études in vivo soulignent l’importance de l’AM pour promouvoir la croissance tumorale et affecter le microenvironnement de la tumeur en induisant une angiogenèse et une lymphangiogenèse pathologiques. L’angiogenèse est une étape clef du développement tumoral ; c’est un mécanisme multifactoriel qui permet l’établissement de néovaisseaux stables et fonctionnels, sans lesquels les cellules tumorales asphyxiées ne peuvent croître. L’ensemble de notre travail soulève plusieurs questions fondamentales sur le rôle spécifique de l’AM dans les évènements cellulaires et moléculaires aboutissant à la mise en place d’une angiogénèse et/ou vascularisation tumorale stable et fonctionnelle. Par conséquent, la compréhension des mécanismes moléculaires permettant à l’AM de mettre en place une néovascularisation stable et fonctionnelle dans un contexte tumoral sera l’axe principal de nos recherches, avec l’utilisation du glioblastome (GBM) comme modèle.
Notre objectif général est d'étudier le rôle spécifique de l'AM dans la croissance et le système vasculaire du glioblastome. Notre hypothèse de travail est que l’AM est impliqué dans une cascade d'événements moléculaires et cellulaires qui conduisent finalement à la stabilisation des vaisseaux fonctionnels pour soutenir la croissance du glioblastome. En conséquence, nous avons l'intention de développer les objectifs suivants: Objectif 1: déterminer le rôle de l’AM dans la mobilisation, le recrutement et l'incorporation de cellules dérivées de la moelle osseuse (BMDC) provasculaires et pro-angiogéniques dans la néovascularisation tumorale (cellules progénitrices endothéliales et murales); étudier le rôle de AM dans la néoangiogenèse et / ou la vasculogenèse au cours d'une récidive de gliome après une radiothérapie ; Objectif 2: les mécanismes moléculaires activés par l’AM pour stabiliser les néovaisseaux sanguins de la tumeur et rôle du système de l’AM dans l’interaction cellules endothéliales/péricytes ; Objectif 3: rôle du système AM dans la fonction des cellules vasculaires associées au glioblastome; Objectif 4: traitement en monothérapie ou combiné en ciblant le système AM et d’autres cibles thérapeutiques utilisant des «médicaments classiques ou innovants » dans le domaine du GBM.
1. Rôle de l’AM dans la mobilisation et le recrutement de cellules dérivées de la moelle osseuse pro-vasculaires et pro-angiogéniques dans la néovascularisation tumorale
Nous évaluerons l’expression des récepteurs AM dans différents types de BMDC, si ces cellules peuvent être mobilisées in vitro et in vivo par l’AM, si l’AM peut induire le recrutement de cellules provasculaires (cellules progénitrices endothéliales et cellules péricytes), si des cellules proangiogéniques dérivées de la moelle osseuse sont recrutées sur le site néo-angiogénique dans les GBM. Nous aborderons également le rôle des activités des métalloprotéases (MMP) telles que MMP2, MMP9, MMP14 et uPA exprimées par les BMDC recrutés. Nous déterminerons si l'AM induit l'expression des MMP et uPA, et le rôle de ces protéases dans le remodelage du microenvironnement tumoral. Enfin, nous évaluerons comment l’inhibition du système AM par les aAM et aAMR, ainsi que par les antagonistes, interfère dans ce recrutement.
Dans cette perspective nous étudierons le rôle de l’AM dans la néoangiogenèse et / ou la vasculogenèse au cours d'une récidive de gliome après une radiothérapie (RT). En effet, la RT serait à l’origine de l’apparition des zones d’hypoxie qui auront comme conséquence une surexpression de différents facteurs dont l’AM.
Nous nous concentrerons sur plusieurs paradigmes expérimentaux avec l’injection orthotopique de cellules U87 MG chez des souris nude pour démontrer et valider notre hypothèse de travail. L'expression de AM, ainsi que d'autres facteurs de croissance et angiogéniques, sera réalisé dans les xénogreffes des modèles orthotopiques U87 et dans des cohortes d'échantillons de paires de GBM prélevés en pré et post-radiothérapie.
2. Rôle et mécanismes d'action de l’AM dans la stabilisation des vaisseaux sanguins tumoraux dans le GBM
Les vaisseaux sanguins matures sont caractérisés histologiquement par une association de péricytes / cellules musculaires lisses et une membrane basale mature. La membrane basale vasculaire est un complexe auto-assemblé supramoléculaire de protéines, glycoprotéines et protéoglycanes qui enveloppe étroitement les cellules endothéliales et les péricytes des vaisseaux sanguins. Le collagène de type IV, la laminine, la fibronectine et le protéoglycane sulfate d'héparane sont parmi les principaux composants. Nous nous concentrerons donc sur le rôle de l’AM dans les interactions adhésives cellule endothéliale/matrice et sur le rôle du système de l’AM dans les interactions étroites entre les cellules endothéliales et les cellules murales (péricytes).
3. Expression et rôle du système AM dans les cellules vasculaires associées au glioblastome
Notre hypothèse de travail est que les cellules vasculaires associées aux GBM (GVC) pourraient exprimer et sécréter l’AM pour soutenir, promouvoir et stabiliser un réseau vasculaire d’une manière indépendante de cellules tumorales du GBM. Les cellules endothéliales (GEC) avec les cellules péricytes (GPC) associées au GBM et les cellules gliales tumorales seront isolées afin d'évaluer l'expression des ARNm de l’ AM et des récepteurs AM (CLR, RAMP2 et RAMP3). Nous allons maintenir ces cellules en culture afin de doser la sécrétion de AM immunoréactive qui pourrait jouer un rôle autocrine/paracrine dans la formation d’un réseau vasculaire.
Nous déterminerons si l'AM est capable d'induire la différenciation des GEC en structures en forme de cordon sur Matrigel, le rôle du système AM dans l'interaction étroite entre les GEC et les GPC et déterminerons la place du système AM dans cette interaction cellules endothéliales/cellules péricytaires. Comme pour le recrutement de GPC afin de construire une néovascularisation, le test d’angiogenèse in vivo avec du Matrigel mélangé à un milieu sécrété par des GEC contrôles et des GEC transfectées avec un shRNA ciblant l’ARNm AM sera utilisé. Différents groupes d'animaux seront traités avec aAM et aAMR pour bloquer le système AM, ou par IgG pour le groupe contrôle seront utilisés dans ce paradigme expérimental.
4. Plan thérapeutique : inhibition de la croissance tumorale de glioblastome par neutralisation du système AM avec des anticorps monoclonaux en monothérapie ou en association avec des médicaments classiques ou innovants.
Nous avons développé des anticorps monoclonaux neutralisants générés contre le peptide AM. En conséquence, nous prévoyons d’étudier les effets in vitro de l’AM-mAb et de chemAMR-mAb sur la prolifération, la migration et l’invasion des cellules dérivant de GBM (U87, U138, U251, T98G). Nous évaluerons les effets de l'AM-mAb sur l'angiogenèse in vitro et analyserons l'effet de l'AM-mAb dans des modèles in vivo d'angiogenèse et sur la croissance tumorale dans des modèles tumoraux de xénogreffes de GBM. Nous étudierons les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l'AM- mAb inhibe la croissance tumorale. Enfin, le traitement aux mAbs contre le système AM associé au témozolomide, à l'Avastin (anti-VEGF mAb), au DC101 (anti-VEGFR2 mAb), à l'OTX015 (MK-8628) et aux inhibiteurs de la voie CXCL12-CXCR4 (AMD 3100) sera évalué dans les modèles hétérotopiques et orthotopiques.
