PINT

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Description: 

La Plateforme INteractome Timone (PINT) offre une expertise unique dans l’analyse thermodynamique et cinétique des interactions moléculaires.

PINT est équipée de microcalorimètres (ITC et DSC), de nanoDSF, de spectrophotomètres et d’une Ultracentrifugeuse Analytique (UCA), auxquels viendra bientôt* s’ajouter un biocapteur optique basé sur la résonance plasmonique de surface (SPR).

Ces techniques ont toutes pour objet de caractériser les interactions moléculaires (protéines, acides nucléiques, sucres, lipides, petites molécules, peptides, protéoliposomes, particules virales, etc…). Elles ont en commun l’absence d’utilisation de réactifs marqués, la simplicité et la rapidité de mise en œuvre. La complémentarité de ces techniques étant largement référencée dans le cadre des interactions protéines-ligands le regroupement des expertises présentes sur les sites Nord et Timone au sein d’un même plateau représente un apport majeur pour le projet NeuroTimone.

Cette plateforme est ouverte à la communauté de chercheurs académiques comme industriels.

*Pour le moment le plateau microcalorimètre Timone et l’ultracentrifugation analytique sont localisés sur la Faculté de Pharmacie alors que la SPR se trouve à Nord, mais l’ensemble sera regroupé au sein de la Faculté de Médecine prochainement (fin 2018).

 

Responsable Plateforme: Hervé KOVACIC, herve.kovacic@univ-amu.fr   - tél : 04 91 83 56 27

Responsable Pôle Microcalorimétrie : François DEVRED, francois.devred@univ-amu.fr  - tél : 04 91 83 55 96

Responsable Pôle Ultracentrifugation Analytique : Pascale BARBIER, pascale.barbier@univ-amu.fr – tel : 04 91 83 56 16

Responsable Pôle Résonance Plasmonique de Surface : Géraldine FERRACCI

Pôle Microcalorimétrie

Situé dans l'aile B au 2ème étage de la faculté de Pharmacie, sur le site Timone, il est équipé de 3 microcalorimètres: ITC200, VP-ITC et VP-DSC permettant à la fois de mener des études de calorimétrie de titration isotherme (ITC) et de calorimétrie à balayage de température (DSC), ainsi que d'un nanoDSF NT.Plex.

  • L'ITC permet de caractériser les interactions intermoléculaires en obtenant leur profil thermodynamique complet : constante d'affinité, stœchiométrie, enthalpie et entropie.
  • La DSC et le DSF permettent de déterminer la thermostabilité (5-120 °C) de protéines, ADN, micelles ... ce qui donne notamment des indications sur la structure tertiaire des molécules et les interactions moléculaires. Le nanoDSF par l'utilisation de capillaires peut aussi être utilisé pour faire du screening d'interactions.

 

Pôle Ultracentrifugation Analytique (UCA)

Situé dans l'aile A au 2ème étage de la faculté de Pharmacie, sur le site Timone, il est équipé d’une Ultracentrifugeuse Analytique Beckman XLA.

L'UltraCentrifugation Analytique (UCA) permet l’étude du comportement des macromolécules  natives  et en solution, soumises à une force centrifuge. A l’aide d’un système de détection qui permet de mesurer la concentration en macromolécule en fonction du rayon de centrifugation, nous pouvons effectuer deux types d’expériences qui vont conduire à l’obtention d’informations complémentaires :

  • La vitesse de sédimentation permet d’obtenir le coefficient de sédimentation, la forme, l’état associatif (monomère, dimère, trimère,…) d’une macromolécule. Elle peut aussi mettre en évidence la formation d’un complexe et permettre la détermination de sa constante d’affinité.
  • L’équilibre de sédimentation permet d’obtenir la masse, l’état associatif (monomère, dimère, trimère,…) et de mettre en évidence la formation d’un complexe macromoléculaire.

 

Pôle Résonance Plasmonique de Surface (SPR)

Actuellement situé sur le site de la faculté de Médecine Nord au sein de la PFRN (voir lien web pour plus de détails) il est équipé actuellement de trois biocapteurs : Biacore T200, Biacore 3000 et ProteOnXPR36.

La Résonance plasmonique de surface permet d’analyser les processus de reconnaissance entre un ligand immobilisé sur une surface d’or et une biomolécule en solution. Les informations obtenues concernent l’affinité (KD) et la mesure des paramètres cinétiques de l’association (ka) et de la dissociation (kd) des complexes, les constantes thermodynamiques, la concentration active d’un analyte. L’ensemble de ces paramètres permet une caractérisation fine des interactions protéines-protéines et protéines-ligands.

Avec un mode d’analyses automatisées, parallélisées et miniaturisées, les biocapteurs optiques SPR permettent en outre de définir des cartographies épitopiques, de valider et caractériser des molécules recombinantes, la détection de molécules dans des milieux complexes, la micropurification et récupération de partenaires inconnus.

Principe de la technologie SPR (Surface Plasmon Resonance)

Les systèmes SPR sont conçus pour visualiser en temps réel des interactions entre biomolécules non marquées. Pour cela, un des réactifs, le ligand, est retenu sur la sensor chip et les autres partenaires de l’interaction, appelés analytes, sont injectés à un débit constant à l'aide d'un circuit microfluidique. Le principe de la SPR permet de suivre à tout moment les changements de masse à la surface de la sensor chip, induits par la formation puis la dissociation des complexes moléculaires. L’intensité du signal mesuré dépend à la fois du nombre de ligands immobilisés sur la sensor chip et de la masse des analytes injectés. Pour une quantité fixe de ligand immobilisé, la sensibilité de détection sera d’autant plus élevée que l’analyte a une masse importante. Inversement, il est possible de détecter l’interaction de petits partenaires seulement si une densité suffisante de ligands (nombre de sites récepteurs élevé) est immobilisée. C’est l’exploitation de la mesure en temps réel qui va permettre d’obtenir une cinétique de l’interaction donnant accès aux paramètres dynamiques (constantes cinétiques d’association et de dissociation) et d’en déduire l’affinité.

Exemples d’applications

  • caractérisation d’interactions protéine-protéine, protéine-petite molécule, protéine-sucre, protéine-ADN/ARN, protéine-cellule, protéine-particule virale :
  • détermination des constantes cinétiques : constantes d’association (ka) et de dissociation (kd)
  • détermination des constantes d’affinité  (KD  et KA)
  • détermination des constantes thermodynamiques de l’interaction (ΔG et ΔH ; analyses à différentes températures)
  • caractérisation d’anticorps : criblage et sélection du meilleur anticorps, détermination des constantes cinétiques et d’affinité, identification d’épitopes, suivi d’immunisation etc. ;
  • analyse de processus de compétition ou d’assemblages multi-moléculaires : crible de drogues inhibant une interaction, caractérisation de sites d’interaction par compétition, analyse de complexes impliquant plusieurs partenaires ;
  • étude de protéines membranaires : à partir de membranes biologiques, de protéoliposomes ou liposomes ;
  • mesure de la concentration active d’une biomolécule sur la base d'une interaction spécifique de haute affinité liant un partenaire ;
  • ligand-fishing : capture, isolement et récupération de partenaires d’interaction inconnus, pour une identification par spectrométrie de masse.

Avantages de la technologie

  •  études qualitatives et quantitatives sans marquage de l’un des partenaires ;
  •  Sensibilité élevée (détection de l’interaction à partir d’environ 1 pg de protéine), et faibles quantités de matériel biologique requis (quelques dizaines de microgrammes) ;
  • enregistrement de l’interaction en quelques minutes et en temps réel ;
  • large gamme d’affinité (KD compris entre 10-3 et 10-12 M), mesure des paramètres cinétiques (kon et koff) ;
  • biomolécules de nature très variées (ADN, ARN, peptides, protéines, lipides, sucres, membranes biologiques natives, molécules pharmacologiques).

 

 

Détails

Certification: 

Les Plateaux Microcalorimétrie Timone et UCA sont rattachés à la structure PIT2 de la Faculté de Pharmacie de Marseille et membre de Marseille Protéomique (Label Ibisa) jusqu’au 31 décembre 2018.

Le plateau de SPR est membre du centre d’analyse protéomique de Marseille (CAPM) de la Faculté de Médecine Marseille Nord et membre de Marseille Protéomique (Label Ibisa) jusqu’au 31 décembre 2018.

La création de PINT sur le site Timone au sein du projet plateformes NeuroTimone (PFNT) permettra le regroupement de techniques complémentaires pour l’analyse des interactions moléculaires sur un même site. Cette structure insérée dans les Plateformes NeuroTimone a été labélisée récemment par Aix-Marseille Université (2018-2020) et est adossée à l’INP.

Tarification: 

Ces tarifs sont indicatifs et toute demande de prestation sera soumise à un devis

TARIFS de PRESTATTIONS PINT

  Laboratoires ACADÉMIQUES LABORATOIRES ET ENTREPRISES PRIVĖES
Biocapteurs Biacore T200

300€ HT/jour dans le cadre d’une collaboration

500€ HT/jour hors collaboration

700€ HT/jour

UltraCentrifugueuse Analytique XLA Beckman

300€ HT/jour dans le cadre d’une collaboration

500€ HT/jour hors collaboration

700€ HT/jour

Microcalorimètrie IT C200, VP-DSC, nano DSF

Le coût des consommables est à ajouter aux tarifs de la microcalorimètrie

300€ HT/jour dans le cadre d’une collaboration

500€ HT/jour hors collaboration

1000€ HT/jour